在幕府大老井伊直弼的冷血屠杀下，反对派被镇压了下去，尊攘志士们暂时蛰伏，而德川庆福得以继任为幕府将军，并且改名为德川家茂。然而井伊大老并高兴不了多久，很快他就变成了尊攘派的刀下之鬼。
且说在安政大狱兴起以前，水户藩很多激进的尊攘志士就齐集江户，大狱兴起后，井伊直弼向水户藩施压，要求召回这些过激分子。其中部分志士被迫归藩，部分人则干脆脱藩，在江户城中潜伏了下来，打算寻找时机为主家复仇。
次年为安政六年（1860年，后改为万延元年），三月三日上午九时，井伊直弼离开自己在外樱田地区的官邸，前往江户城中办公。据说行前就有人警告 说，近来城中发现很多前水户藩士，行动诡秘，恐怕将不利于大老，请求增加警卫力量。然而井伊直弼却回答道：“人的命运由上天注定，如果真有刺客想要杀死 我，他们可以寻找各种机会，加强警卫是没有用的。况且对于出行的队列，幕府有着严格规定，身为大老，我怎能率先破坏制度呢？”
大老的随从和警护人员一共六十人，簇拥着乘轿的井伊直弼通过江户市街，此事天降大雪，寒风卷着雪花扑向行进队列——因为寒冷，街面上行人很少。在经过外樱田门前的杵筑藩藩邸之时，刺客们突然出现了。
刺客的首脑乃是水户藩的激进尊攘派金子孙二郎，他聚集了包括水户脱藩志士高桥多一郎、关铁之助，以及萨摩脱藩志士有村次左卫门等共十八人，早就埋伏 在外樱田门外。当井伊大老的轿子到来之时，刺客们披风冒雪，一拥而上。轿中的井伊直弼匆忙掏出短枪，射倒了志士森五六郎，但随即就被五、六柄长刀刺中，一 句话都没来得及说就咽了气。
这就是著名的“樱田门外之变”。
井伊大老的被刺，对于日本社会的转型起到了非常深刻的作用。一方面，气焰大降的幕府在安抚彦根藩士的同时，也处罚了被视为井伊派的纪州藩家老水野忠 央，并且解除了对德川庆恕、德川庆笃、德川庆喜、松平庆永、山内丰信等人的处分，实际上是在血的教训下被迫向雄藩们低下了“尊贵”的头颅。
然而在幕府作出让步的同时，各地雄藩也因为“安政大狱”而收敛了原本的狂妄姿态，转而向幕府靠拢。在井伊直弼之后掌握幕权的老中安藤信正改变了井伊 大老的铁血手段，一方面停止对“一桥派”藩主们的迫害，一方面恭顺地对待朝廷，想要利用朝廷的权威来巩固幕府的统治。安藤老中提出迎娶孝明天皇的妹妹和宫 为家茂将军的正室夫人，从此公家和武家联起手来应对乱局——这一举措被称为“公武合体”，受到了尊攘派各藩藩主和重臣们的一致赞同。
雄藩的上层就这样被幕府拉拢过去了，然而已经在各藩内崛起的中下级武士却对此大感不满，尤其是吉田松阴的弟子们，他们秉承被害恩师的思想，认定尊王 则必须倒幕，绝不能向幕府妥协，绝不能再让幕府延续其腐朽的统治。上层尊攘派和下层尊攘派就此分裂为两个阵营。在这种态势下，文久二年（1862年），安 藤老中在江户坂下门外遭到水户藩志士的袭击，虽然侥幸逃得了性命，却很快就被赶下了台。
水户藩尊攘先锋的地位自“坂下门外之变”后就逐渐丧失了，在藩主德川庆笃等人的着力压制下，逐渐地水户藩站到了幕府一边，反而成为“尊王佐幕”的急先锋，而代替水户藩举起尊攘派大旗，决定以武力推翻幕府的，则是西国的长州毛利藩和萨摩岛津藩。
顺便一提，以刺杀井伊大老为开端，各地大批尊攘志士脱藩，混入京都和江户城中，对他们所看不惯的大人物们挥舞刀剑，认为这才是救国之道。一时间，血 雨腥风洒满了这两座名都，到处都是口呼“天诛”的志士，这些人被称为“人斩”。文久二年（1862年），土佐藩大思想家吉田东洋被本藩的那须信吾等人所 杀；同年，佐幕派官僚岛田左近被萨摩藩志士田中新兵卫所杀；元治元年（1864年），主张公武合体和开国论的大思想家佐久间象山被熊本藩志士河上彦斋所 杀……
为了扭转日益恶化的治安，恢复京都的秩序，幕府招募了大批浪人，组建起一支名为“浪士队”的准警察部队。其后“浪士队”改名“新征组”，被调往江 户，很多成员不愿意离开京都而滞留了下来，为了避免这些浪人成为更大的祸害，京都守护职、会津藩主松平容保把其中部分人招募到麾下，组成了“新选组”。
新选组的中坚分子，乃是以近藤勇为首的来自于武藏国多摩郡乡下的一批下级武士，这个组织以行动迅速，下手狠辣而享誉一时。但在恢复京都治安的同时，新选组逐渐成为佐幕派的一枚棋子，成为屠杀尊攘志士的刽子手，成为逆潮流而行的反动者，这实在是相当可悲的事情。
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